Galvenie dizaina apsvērumi attiecībā uz gēnu terapijas produktu vīrusu attīrīšanas validācijas pētījuma protokoliem

ICH Q5A(R2)-Starptautiskais saskaņošanas fonds

ICH Q5A(R2) tika oficiāli pieņemts 2023. gada 1. novembrī, un tas ir galvenais starptautiskais vadlīniju dokuments vīrusu drošības novērtēšanai. Salīdzinot ar 1999. gadā publicēto Q5A(R1), nozīmīgie atjauninājumi R2 versijā ietver: tikko pievienotu nodaļu par vīrusu drošības novērtēšanu nepārtrauktā ražošanā (7. nodaļa); pastiprināta riska novērtējuma loma kā vīrusu likvidēšanas stratēģiju pamats; nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) iekļaušana vīrusu noteikšanas apsvērumos; un skaidras prasības jaunu produktu un ražošanas procesu novērtēšanai. Q5A(R2) ir pieņēmušas regulatīvās iestādes, tostarp FDA, EMA un PMDA, nodrošinot vienotu tehnisko sistēmu vīrusu attīrīšanas validācijai visā pasaulē.

NMPA{0}}Ķīnas regulēšanas sistēma

NMPA tiesiskais regulējums vīrusu drošībai aptver vairākus līmeņus:

Dokumenta līmenis	Dokumenta nosaukums	Izdošanas gads
Pamatdokuments	Tehniskās vadlīnijas vīrusu noņemšanai/inaktivēšanai no asins pagatavojumiem	2002
Pamatdokuments	Vispārīgie principi bioloģisko audu{0}}atvasināto produktu un eikariotu šūnu-izpausto produktu vīrusu drošības novērtējuma tehniskajai pārskatīšanai	2005
Produkta{0}}konkrētās vadlīnijas	Tehniskās vadlīnijas farmaceitiskajai izpētei un klīnisko izmēģinājumu lietojumu novērtēšanai rekombinantā adeno{0}}saistītā vīrusa (rAAV) vektora-uz in vivo gēnu terapijas produktiem	2023
Produkta{0}}konkrētās vadlīnijas	Kopējās tehniskās prasības attiecībā uz rekombinanto adeno{0}}saistīto vīrusu (rAAV) vektora-in vivo gēnu terapijas produktu farmaceitisko kvalitāti tirdzniecības atļauju pieteikumiem	2025
Inovatīva vadlīnija	Tehniskās vadlīnijas vīrusu attīrīšanas procesu platformas validācijai terapeitisko rekombinanto proteīna produktu klīniskajos pētījumos (izmēģinājums)a	2024

a: Šīs vadlīnijas ir pirmā reize, kad Ķīnas regulatīvā iestāde ir noteikusi sistemātiskas tehniskās prasības vīrusu attīrīšanas procesu platformas validācijai, un tās ir saskaņotas ar ICH Q5A(R2) garu.

FDA un EMA{0}}ASV un Eiropas normatīvās prasības

2024. gada janvārī FDA oficiāli izdeva nozares vadlīniju dokumentu, pamatojoties uz ICH Q5A(R2). Turklāt Amerikas Savienoto Valstu farmakopejas (USP) nodaļa<1050.1>sniedz papildu tehniskos norādījumus par vīrusu attīrīšanas procedūru izstrādi, novērtēšanu un raksturošanu. FDA ik pēc diviem gadiem organizē vīrusu attīrīšanas simpoziju; 2023. gada simpozijā tika aplūkotas jaunākās -tēmas, piemēram, jaunas metodes, nepārtraukta ražošana, jauni hromatogrāfijas materiāli un adsorbējošie filtri. EMA pamatnostādņu dokumenti ietver CPMP/BWP/268/95 (Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Virus) un EMEA/CHMP/BWP/398498/2005. Produkti), kas abi ir saskaņoti ar ICH Q5A(R2).

Vīrusu piesārņojuma avotu identificēšana

ICH Q5A(R2) uzsver, ka vīrusu klīrensa validācijas plānojumam jābalstās uz visaptverošu riska novērtējumu. Attiecībā uz gēnu terapijas produktiem vīrusu piesārņojuma avotu identificēšanai jāattiecas uz šādiem līmeņiem:

Šūnu bankas līmenis: endogēni vīrusi (piemēram, retrovīrusu daļiņas) un latenti infekciozi vīrusi, kas potenciāli atrodas ražošanas šūnu substrātos (piemēram, HEK293, CHO, HeLa). Ir zināms, ka HEK293 šūnas satur endogēnas Ad5 E1 sekvences un aptuveni 900 bp EBV fragmentu, un tās spēj ekspresēt kompetentu adenovīrusu; tādēļ riska novērtējumā šim riskam jāpievērš īpaša uzmanība.

Helper vīrusa līmenis: AAV vektora ražošanā parasti tiek izmantotas tādas metodes kā trīskāršā transfekcija, izmantojot palīgplazmīdas, kas rada replikācijas -kompetenta adenovīrusa (RCA) ģenerēšanas risku. Tāpat lentivīrusu vektoru ražošanā izmantotās iepakojuma šūnas var radīt replikācijas -kompetentu lentivīrusu (RCL).

Izejvielu līmenis: nejaušus vīrusus var ievadīt ar ražošanā izmantotajām izejvielām, tostarp šūnu barotnēm, barību un fermentiem. Šis risks ir īpaši nozīmīgs, ja tiek izmantoti{1}}dzīvnieku izcelsmes komponenti (piemēram, liellopu augļa serums, tripsīna gremošanas šķīdumi).

Riska atšķirības: gēnu terapija pret tradicionālajiem rekombinantajiem proteīniem

Riska dimensija	Tradicionālie rekombinanto proteīnu produkti	Gēnu terapijas produkti
Vīrusu avots	Endogēni vīrusi no šūnu bankas; nejauši vīrusi	Šūnu bankas vīrusi; palīgvīrusi; replikācijas{0}}kompetentie vektori (RCV/RCL); saimnieka genoma integrācija
Šūnu substrāts	CHO, NS0, Sp2/0 un citas labi-raksturīgas šūnu līnijas	HEK293, HeLa, CHO utt.; dažām šūnu līnijām ir audzēja izcelsme
Produkta īpašības	olbaltumvielas{0}}balstītas zāles; labi-definēta struktūra	Vīrusu vektors; rada bioloģiskās drošības riskus
Validācijas stratēģija	Daudzpakāpju vīrusu klīrenss; uzsvars uz procesa posma validāciju	Nepieciešama RCV/RCL noteikšana; gan validācija, gan testēšana
Platformas validācija	Piemērojams tādiem vispāratzītiem procesiem kā S/D, zems pH līmenis, nanofiltrācija	Ierobežota pielietojamība vektoru tipu daudzveidības dēļ

1. tabula. Vīrusu drošības risku salīdzinājums: gēnu terapijas produkti pret tradicionālajiem rekombinanto proteīnu produktiem

Vispārīgie principi

Indikatora vīrusa izvēle ir galvenais elements vīrusu attīrīšanas validācijas protokolu izstrādē. ICH Q5A(R2) nosaka, ka indikatorvīrusa atlase jābalsta uz riska novērtējumu un jāņem vērā šādi faktori:

Vīrusa atbilstība ražošanas šūnas substrātam (attiecīgais vīruss)

Vīrusa fizikāli ķīmiskās īpašības (apvalkots/be{0}}apvalks, DNS/RNS, izmēru diapazons)

Vīrusa izturība pret fizikālu/ķīmisku apstrādi

Vīrusa nosakāmība un bioloģiskā drošība

Gēnu terapijas produktiem, izvēloties indikatorvīrusu, papildus jāņem vērā: paša vektora vīrusa kā "attiecīgā vīrusa" loma; iespējamais palīgvīrusu inficēšanās risks; un kompetento vīrusu (RCV/RCL){0}replicēšanas un apstiprināšanas prasības.

Ieteicamais indikatora vīrusu panelis

Vīruss	Tips	Aploksne	Genoms	Izmērs (nm)	Atlases pamatojums/pielietojums
MVM	Parvovīruss	Nav	ssDNA	18–26	Bez{0}}aploksnes modelis; mazākais izmērs un visaugstākā pretestība; piemērots nanofiltrācijas validācijai (parasti nav piemērojams rAAV vektora produktiem)
PPV	Parvovīruss	Nav	ssDNA	18–26	Bez{0}}aploksnes modelis; plaši izmantotais indikatorvīruss asins pagatavojumiem
Reo-3	Reovīruss	Nav	dsRNS	60–80	Bez{0}}aploksnes modelis; vidēja izmēra; augsta fiziskā stabilitāte
PRV	Herpesvīrusi	Jā	dsDNS	150–200	Aploksnes modelis; liels izmērs; plašs saimniekdatoru klāsts
X-MuLV	Retrovīruss	Jā	ssRNS	80–110	Retrovīrusa modelis ar apvalku; piemērots CHO{0}}atvasinātiem šūnu substrātiem
BVDV	Flaviviridae	Jā	ssRNS	40–60	Aploksnes modelis; izmanto, lai novērtētu ķīmiskās inaktivācijas metodes (HCV surogāts)
VSV	Rhabdoviridae	Jā	ssRNS	70	Aploksnes modelis; plaša pH tolerance; piemērots zema{0}}pH inaktivācijas validācijai

2. tabula. Ieteicamais indikatora vīrusu panelis gēnu terapijas produktu vīrusu attīrīšanas validācijai

Īpaši apsvērumi AAV Vector produktiem

Attiecībā uz rekombinantiem AAV vektora produktiem NMPA tehniskajās vadlīnijās par rAAV Vector{0}}bāzētu gēnu terapijas produktu in vivo balstītu farmaceitisko izpēti un klīnisko izmēģinājumu lietojumu novērtēšanu jāpievērš uzmanība kompetentā AAV (rcAAV) replikācijas noteikšanai. rcAAV attiecas uz AAV, kas spēj autonomi replikēties, kas parasti rodas no homologas rekombinācijas starp palīgplazmīdu un produkta AAV genomu. rcAAV noteikšanu parasti veic, izmantojot infekcijas testus vai qPCR metodes, ko veic atsevišķi ar zāļu vielu un attīrīto produktu.

Ir vērts atzīmēt, ka AAV vektora produktu pakārtotie attīrīšanas procesi parasti ietver nukleāzes gremošanu, hromatogrāfiju (AEX), nanofiltrāciju un jonu apmaiņas hromatogrāfiju (CEX/IEX). Tradicionālajā vīrusu attīrīšanas validācijā šīs procesa darbības var izraisīt ievērojamus paša AAV vektora zudumus; tāpēc, izstrādājot samazināto-modeli, rūpīgi jāapsver mijiedarbība starp vektoru un indikatorvīrusiem. Atsevišķos procesa posmos (piemēram, nanofiltrācijai), kur AAV vektora zudumi ir būtiski, ir jānovērtē, vai procesa korekcijas ir pamatotas, pamatojoties uz validācijas datiem (piemēram, nanofiltrācijas membrānas poru izmēra pielāgošana).

Vispārīgie principi

Samazinātais-modelis (SDM) ir galvenais vīrusu attīrīšanas validācijas rīks; tā konstrukcijai precīzi jāatspoguļo ražošanas procesa vīrusu attīrīšanas veiktspēja. ICH Q5A(R2) 6.2.2. sadaļā ir skaidri noteikts, ka mērogojamā-modelis saglabā galveno parametru atbilstību ražošanas procesam. Attiecībā uz gēnu terapijas produktiem SDM projektēšanā īpaši svarīgi ir šādi apsvērumi:

Kritisko procesu parametru reprezentativitāte

Samazinātajam -mazinājuma modelim ir jāatbilst ražošanas procesam šādos parametros: hromatogrāfiskie apstākļi (bufera sastāvs, pH, vadītspēja); slodzes attiecība (vektora/supernatanta proteīna masas attiecība); kontakta laiks un temperatūra; plūsmas ātrums/uzturēšanās laiks; produkta tīrība un sastāvs. Attiecībā uz AAV produktiem īpaši jāpievēršas arī vektora daļiņu izmēra sadalījuma un tukšā kapsīda satura ietekmei uz nanofiltrācijas veiktspēju.

Modeļa kvalifikācijas prasības

ICH Q5A(R2) nepieciešama atbilstoša mēroga -mazākuma modeļa kvalifikācija, tostarp: produkta kvalitātes atribūtu salīdzinājums (piemēram, tīrība, reģenerācija, blīvums); kritisko procesu parametru konsekvences kvalifikācija; un nodrošinot, ka samazinātā-modelis atspoguļo ražošanas procesa mainīgumu. Hromatogrāfijas posmos ir jākvalificē pīķa profila, eluēšanas un mazgāšanas konsistence; nanofiltrācijas posmiem ir jāpārbauda tilpuma jaudas un produkta sastāva ietekme.

LRV aprēķina formula

Log samazinājuma vērtība (LRV) ir galvenā metrika vīrusa klīrensa efektivitātes mērīšanai. ICH Q5A(R2) 6.5. sadaļa sniedz detalizētu LRV aprēķina metožu un statistiskās apstrādes aprakstu. LRV aprēķina pamata formula ir: LRV=log₁₀(N₀/N), kur N₀ ir sākotnējais vīrusa titrs pēc vīrusa palielināšanās un N ir atlikušais vīrusa titrs pēc apstrādes procesa. Ja atlikuma vīrusa titrs nokrītas zem testa noteikšanas robežas, jāizmanto tādas novērtēšanas metodes kā Puasona sadalījums (piemēram, liela -apjoma pārbaude).

Uzticības intervālu pielietošana

Gan ICH Q5A(R2), gan EMA CPMP/BWP/268/95 prasa LRV aprēķinu rezultātu ticamības intervāla novērtējumu. Parasti tiek piemērots 95% ticamības intervāls.

Efektivitātes kritēriji

Saskaņā ar NMPA tehniskajām vadlīnijām vīrusu noņemšanai/inaktivēšanai no asins pagatavojumiem, vīrusa samazinājums, kas ir lielāks vai vienāds ar 4 žurnāliem, norāda, ka procesa darbība ir efektīva vīrusu noņemšanai/inaktivēšanai. Tomēr šis kritērijs nav absolūts slieksnis, un tas ir jānovērtē holistiskā veidā kopā ar inaktivācijas kinētikas līknēm, indikatorvīrusa atlases zinātnisko pamatojumu un validācijas protokola dizaina vispārējo pamatotību. Attiecībā uz gēnu terapijas produktiem īpaša uzmanība būtu jāpievērš kumulatīvās klīrensa spējai visos procesa posmos, lai nodrošinātu, ka kopējais vīrusu drošības profils ir pieņemamā līmenī.

Nanofiltrācijas pielietojums un izaicinājumi

Vīrusu-retentīvā filtrēšana (nanofiltrācija) ir būtisks vīrusu attīrīšanas posms gēnu terapijas produktu pakārtotajā attīrīšanā. Tipiskiem vīrusu{2}}aizturošajiem filtriem poru izmērs ir aptuveni 20 nm. Nanofiltrācijas vīrusa attīrīšanas mehānisms galvenokārt ir balstīts uz izmēru{5}}, un tas var efektīvi noņemt lielāko daļu vīrusu, kas ir lielāki par membrānas poru izmēru, tostarp bezapvalkotus mazus parvovīrusus, piemēram, MVM un PPV.

Tomēr gēnu terapijas produktu nanofiltrācija saskaras ar unikālām problēmām: AAV vektoru izmērs (aptuveni 20–26 nm) ir līdzīgs dažu indikatorvīrusu izmēram (piemēram, MVM, 18–26 nm), kā rezultātā var samazināties vektoru atveseļošanās; tukši kapsīdi var ietekmēt filtrācijas plūsmu un vīrusu aiztures efektivitāti; parauga viskozitāte var ievērojami palielināties līdz ar vektora koncentrāciju. Tāpēc SDM projektēšanā nanofiltrācijas validācijai pilnībā jāņem vērā vektora daļiņu izmēra sadalījuma un tukšo kapsīdu satura ietekme uz filtrēšanas veiktspēju, un būtu jāapsver iespēja izmantot nanofiltrācijas membrānas ar lielākiem poru izmēriem.

Hromatogrāfijas posmu vīrusu klīrenss

Jonu apmaiņas hromatogrāfija (IEX) ir AAV produktu attīrīšanas procesu galvenais posms, kurā parasti izmanto nukleāzes šķelšanu, kam seko anjonu apmaiņas hromatogrāfija (AEX), lai uztvertu tukšas un bojātas kapsīdas, vai katjonu apmaiņas hromatogrāfiju (CEX) pilnu kapsīdu smalkai attīrīšanai. Vīrusu attīrīšanas mehānismi hromatogrāfijas posmos ietver izmēru izslēgšanu, elektrostatisko mijiedarbību, afinitātes mijiedarbību un citus faktorus. Diskusijās FDA 2023. gada vīrusu attīrīšanas simpozijā tika uzsvērts, ka hromatogrāfijas posmu vīrusu attīrīšanas efektivitāti ietekmē vairāki faktori, tostarp slodzes jauda, ​​pH, vadītspēja un sveķu cikliskums; visaptverošai novērtēšanai ir jāpieņem daudzfaktoru ortogonāla dizaina pieeja.

Vīrusu drošības kontrole nepārtrauktā ražošanā

Nesen pievienotajā ICH Q5A(R2) 7. nodaļā ir noteiktas īpašas prasības vīrusu drošības novērtēšanai nepārtrauktā ražošanā. Gēnu terapijas produktu nepārtraukta ražošana ir kļuvusi par svarīgu attīstības virzienu, taču tā arī ievieš jaunus vīrusu drošības izaicinājumus. Vīrusu drošības kontroles stratēģijas nepārtrauktā ražošanā ietver:{5}}līnijas vīrusu barjerfiltrus kā kritiskus ierobežošanas pasākumus; atbilstošs uzturēšanās laiku un procesa plūsmu plānojums; inaktivācijas soļu iekļaušana ar noteiktiem aizturēšanas laikiem; un uzlabota procesa analīzes tehnoloģijas (PAT) pielietošana kritisko procesa parametru{6}}uzraudzībai reāllaikā.